顯微鏡拉曼光譜基于拉曼散射效應(yīng)。當(dāng)特定波長的單色激光(如532nm、633nm或785nm)照射到樣品上時，光子會與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞。這種碰撞并非簡單的反射或折射，而是涉及到分子內(nèi)部能量狀態(tài)的改變。
 

　　能量交換產(chǎn)生頻移：在碰撞過程中，部分光子將一部分能量轉(zhuǎn)移給分子，使自身頻率降低，形成斯托克斯散射；反之，若分子原本處于較高能態(tài)并釋放能量給光子，則光子頻率會增加，形成反斯托克斯散射。這兩種情況均導(dǎo)致散射光的頻率不同于入射光，且攜帶了關(guān)于分子振動、轉(zhuǎn)動等信息的特殊“指紋”。
 

　　信號收集與分析：通過顯微鏡系統(tǒng)準(zhǔn)確聚焦于樣本上的微小區(qū)域，確保只有該區(qū)域的散射光被有效收集。隨后，這些散射光經(jīng)過光譜儀分散成不同波長的光，并由檢測器記錄下其強(qiáng)度分布，生成拉曼光譜圖。此圖譜反映了樣品的結(jié)構(gòu)、成分及狀態(tài)等關(guān)鍵信息。
 

　　顯微鏡拉曼光譜的測定步驟：
 

　　1.設(shè)備啟動與初始化
 

　　-激光主機(jī)開機(jī)：將激光主機(jī)上的電源開關(guān)打開，再將鑰匙逆時針轉(zhuǎn)動以激活激光。
 

　　-顯微鏡開機(jī)：開啟顯微鏡左側(cè)綠色按鈕，并調(diào)節(jié)右側(cè)光源至合適亮度(中間狀態(tài)為關(guān)閉；向上/下按動分別控制上下打光)。
 

　　-電腦及軟件準(zhǔn)備：打開計(jì)算機(jī)，啟動配套的拉曼光譜儀和顯微鏡控制軟件，登錄用戶賬號。在顯微鏡軟件中選擇對應(yīng)的相機(jī)型號進(jìn)入實(shí)時畫面。
 

　　2.樣品放置與定位
 

　　-載樣方式：固體樣品可直接置于載玻片上，液體需覆蓋蓋玻片后固定于載玻片；確保樣品表面平整、無氣泡且厚度控制在1mm以內(nèi)(過厚可能導(dǎo)致信號衰減或散射增強(qiáng))。
 

　　-粗調(diào)焦觀察：通過物鏡從小到大的順序逐步調(diào)焦，直至視野清晰顯示樣品圖像。隨后切換至激光模式，在軟件界面觀察到紅色光斑后微調(diào)位置，使光斑集中明亮。
 

　　3.參數(shù)設(shè)置與校準(zhǔn)
 

　　-測量模式選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定激發(fā)光源功率、積分時間、光譜范圍等參數(shù)。例如，對敏感樣品應(yīng)降低激光功率以避免損傷；對于弱信號樣本可延長積分時間提高信噪比。
 

　　-系統(tǒng)校準(zhǔn)：包括波數(shù)校準(zhǔn)和強(qiáng)度校準(zhǔn)，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性；同時檢查外光路是否對準(zhǔn)，必要時調(diào)整聚光部件使會聚光束聚焦于樣品中心。
 

　　4.數(shù)據(jù)采集與分析
 

　　-單次/多次采集：點(diǎn)擊軟件中的“單次”按鈕開始測量，重復(fù)多次以驗(yàn)證結(jié)果穩(wěn)定性。采集后的光譜以圖形形式呈現(xiàn)，可通過軟件工具進(jìn)行基線校正、峰位識別等處理。
 

　　-數(shù)據(jù)保存與解讀：導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)及處理后的圖譜，結(jié)合數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)對比特征峰歸屬，得出成分或結(jié)構(gòu)信息。